Příprava bakteriálních expresních systémů rekombinantní gama-laktamasy

Abstract

gama-laktamasa je enzym, který dokáže štěpit pětičlenné laktamové cykly. Jeho potenciálním substrátem je polyvinylpyrrolidon (PVP). PVP je obsažen ve větším množství v odpadních vodách, a proto je gama-laktamasa zkoumána také pro následné využití k jejich čištění. Cílem této bakalářské práce bylo přípravit bakteriální expresní systémy rekombinantní gama-laktamasy. Gen pro enzym gama-laktamasy byl již dříve nasyntetizován. Byla provedena pouze PCR enzymu s his-tagem a primery, obsahující restrikční místa. Dále byly provedeny metody k dosažení čistšího produktu. Inserty byly rozštěpeny restrikčními endonukleasami a pomocí DNA ligasy byla provedena ligace do vektorů pET22b a pUC19. Těmito upravenými vektory byly následně transformovány kompetentní bakteriální buňky Escherichia coli DH5-alpha. Pro ověření přítomnosti insertu bylo opět provedeno restrikční štěpení endonukleasami a sekvence jednotlivých klonů byla ověřena sekvenční analýzou. Rekombinantní gama-laktamasou byly transformovány expresní buňky Escherichia coli BL21(DE3)RIL. Byla otestována exprese rekombinantní gama-laktamasy a provedeny pokusy o její izolaci a stanovení aktivity.